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          蛋白質技術專題:血清蛋白瓊脂糖凝膠電泳
        1. 發布日期:2019-02-27     信息來源:      瀏覽次數:1598
          • 【原理】
            瓊脂糖(agarose)是經過挑選,以質地較純的瓊脂(agar)作為原料而制成的。瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖,它具有離子交換性質,這種性質會給電泳及凝膠過濾以的影響。瓊脂糖是直鏈多糖,它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成。
            瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大(98-99%),近似自由電泳,因為固體支持物的影響少,故電泳速度快,區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團,電滲影響很少,是一種較好的電泳材料,分離效果較好。
            血清中脂類物質與血清載脂蛋白結合成水溶性的脂蛋白(lipoprotein)形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同,各種脂蛋白顆粒大小也相差很大,因此,以瓊脂糖凝膠為支持物,在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。
            瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑(或油紅等)進行預染。再將預染過的血清加樣于瓊脂糖凝膠板加樣槽中,通電后可以看到脂蛋白向正極移動,并分離出幾個區帶。
            正常人血清脂蛋白可出現三條區帶,從陰極到陽極依次為β-脂蛋白(深),前β-脂蛋白(淺)及α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原點處應無乳糜微粒。有時前β-脂蛋白也顯示不出來。
            瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大(98-99%),近似自由電泳,因為固體支持物的影響少,故電泳速度快,區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團,電滲影響很少,是一種較好的電泳材料,分離效果較好。
            血清中脂類物質與血清載脂蛋白結合成水溶性的脂蛋白(lipoprotein)形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同,各種脂蛋白顆粒大小也相差很大,因此,以瓊脂糖凝膠為支持物,在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。
            瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑(或油紅等)進行預染。再將預染過的血清加樣于瓊脂糖凝膠板加樣槽中,通電后可以看到脂蛋白向正極移動,并分離出幾個區帶。
            正常人血清脂蛋白可出現三條區帶,從陰極到陽極依次為β-脂蛋白(深),前β-脂蛋白(淺)及α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原點處應無乳糜微粒。有時前β-脂蛋白也顯示不出來。

            【操作】
            1、預染血清血清0.2ml中加蘇丹黑染色液0.2ml,混合置37℃水浴中染色30分鐘,離心(2000轉/分)約5分鐘。以除去懸浮于血清中染料沉渣。
            2、制備瓊脂糖凝膠板將已配制好的0.5%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化,用吸管吸取凝膠溶液澆注在載玻片上,約3 ml。靜置半小時后凝固(天熱時需延長,也可放入冰箱中數分鐘以加速凝固)。
            3、點樣將剪好的濾紙條對折,以折邊在距凝膠一端2cm處切一點樣口。將毛細管插入預染好的血清中,待吸入部分血清后,取毛細管使其有樣品的一端靠于點樣口端部,???秒左右。
            4、電泳將凝膠板平放入電泳槽中,使加樣端接在陰極一側,用四層濾紙或紗布做成“引橋”,敷于膠板的兩端,各搭住凝膠板約1cm左右,“引橋”的另一端浸于電泳槽內的緩沖液中。接通電源,首先調節電流為3-4mA/凝膠板,電泳10-15分鐘;然后調節電流為6-7mA/凝膠板,電泳30-40分鐘,即可觀察到分離的區帶。
            5、如果需要保留電泳圖譜,可將電泳后的凝膠板(連同載玻片)放入清水中浸泡脫鹽2小時,然后放烘箱(80℃左右)中烘干即可。

            【試劑】
            1、蘇丹黑染色液將蘇丹黑B加到無水乙醇中至飽和,搖蕩使乙?;?。用前過濾。
            2、緩沖液稱取鈉15.4g、2.76g及EDTA0.29g,加水溶解后再加蒸餾水至1000ml(pH為8.6,離子強度0.075),為電極緩沖液。
            3、凝膠緩沖液取三羥甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g,用蒸餾水溶解后,稀釋至1000ml,pH為8.6。
            4、瓊脂糖凝膠稱取瓊脂糖0.45 g溶于50 ml凝膠緩沖液中,再加水50 ml。在水浴中加熱至沸,待瓊脂糖*溶解后,立即停止加熱。

            【注意事項】
            1、電泳樣品應為新鮮的空腹血清。
            2、加熱溶化瓊脂時,須防止水份蒸發過多。瓊脂糖凝膠隨用隨制,以免凝膠表面干燥,影響分離效果。
            3、制作凝膠板時瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜,高于1%以上α-脂蛋白部分較緊密,β和前β-脂蛋白部分不夠清晰;低于4.5%則凝固性較差,圖譜不清。
            4、點樣口要大小適宜,邊緣整齊、光滑,否則會影響電泳圖譜。
            5、在α-脂蛋白前若出現較淺區帶,可列為前α-脂蛋白。

            【正常參考范圍】
            α-脂蛋白 20~30%
            β-脂蛋白 20~30%
            前β-脂蛋白 0~28%
            乳糜微粒(-)

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