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          蛋白質純化方法經典攻略(三)
        1. 發布日期:2022-03-18     信息來源:      瀏覽次數:1379
          • 那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白質純化方法經典攻略(三):

            離子交換層析

            離子交換層析分離蛋白的原理是基于其凈電荷的不同,通過蛋白質與帶電荷的固定相之間的靜電作用力進行分離。

            IEX有以下兩類: (1)陰離子交換層析 (固定相帶正電荷,與帶負電的蛋白質相結合);(2)陽離子交換層析(固定相帶負電,與帶正電的蛋白質相結合)。離子交換層析常用于蛋白質純化工藝中期。但是,對某些蛋白,在純化工藝的前期或后期采用該方法亦可獲得良好的分離效果。

                                                                             圖 5. 蛋白質凈電荷受其溶劑pH值影響。

            當pH=pI時,蛋白質凈電荷為0,因此既不與陰離子交換的固定相也不與陽離子交換的固定相相結合。調節pH值高于或低于pI值可使蛋白質帶上凈電荷,使其與陰離子交換樹脂(pH > pI)的固定相或者陽離子交換(pH < pI)的固定相相結合。
            由于氨基酸的基本結構和與其共價結合的修飾成分的影響,所有的蛋白質都會帶有凈電荷。由于溶劑可以與蛋白質相互交換氫離子,因此蛋白質的凈電荷受其溶劑pH值的影響。蛋白質的等電點(pI)是蛋白質不帶電時的pH值。當pH值高于pI時,蛋白質會帶負電,而當pH值低于pI時,蛋白質帶正電。因此,可以通過調節溶液的pH值來控制結合蛋白是與離子交換柱結合或是從柱上洗脫。
            理論上來說,只要緩沖液pH值調節合適,所有的蛋白質都可以與陽離子交換柱和陰離子交換柱結合。但是,蛋白質純化過程中,選擇純化條件和層析柱類型時*重要的考慮因素就是要保持蛋白質的穩定性。因此,選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會影響蛋白質穩定性和活性是必須要考量的。通常,一些與某類離子交換層析相結合的條件可能對某種蛋白質比對其他蛋白質更為合適。
            了解蛋白質等電點的知識可幫助尋找*合適的離子交換層析方法。以下在線工具可計算一個蛋白質的理論等電點 EXPASY。這些計算都*基于蛋白質的氨基酸序列,不考慮其三維空間結構。而在實際情況中,一個蛋白質的某些殘基可能暴露得比其他部分更多,所以,其實際pI和表面凈電荷某些時候可能與理論計算值不盡相符  。氨基酸的相對位置分布同樣會影響一個蛋白質的pI值 ,而這一點在理論計算時同樣未予考慮。有些技術可通過實驗方法測得蛋白質實際的pI值,如等電聚焦電泳 、等電聚焦毛細管電泳 和高通量光學測量法等 。
            蛋白質與IEX的結合必須采用較寬pH值范圍的溶液進行多次嘗試以獲得*合適的蛋白質保留pH值。在pI值左右1個pH單位的溶液pH值通常認為是較合適的蛋白質結合pH值。但是,在有些情況下,也可能需要在遠離pI值的pH值條件下進行 。

            圖 6. 離子交換層析。


            蛋白質在低離子強度條件下與帶電的固定相相結合。結合的蛋白質可以通過增加緩沖液的離子強度或者調節其pH值進行洗脫。
            IEX的固定相是由惰性瓊脂糖或者高分子基質與帶電基團共價結合組成。介質微粒有很多尺寸,可以無孔,也可以有多種不同尺寸的孔。介質的選擇主要根據所需的結合能力、分辨率和流速要求來決定。介質顆粒尺寸越小,分辨率越高,但相應的流速也越低,分離時間也更長。多孔介質比無孔介質的結合能力更強。無孔介質中,蛋白質不能進入樹脂內部,因此相比多孔介質,前者的樣品回收率更高,分辨率更高,分離時間也更短。一個研究表明,對于大多數蛋白質,采用無孔介質和多孔介質的分辨率和回收率都類似,但對于尺寸較大的蛋白質,多孔介質由于體積排阻效應而在分辨率上有一定損失。
            IEX中*常用的4種帶電官能團如下所示。它們根據離子交換能力的強弱分類,強離子交換基團可離子化的pH范圍比弱離子交換基團的范圍更大。
            陰離子交換 (固定相帶正電):1、季銨(Q) - 強陰離子交換基團2、二乙氨乙基(DEAE) -弱陰離子交換基團
            陽離子交換 (固定相帶負電):1、磺酸甲酯(S) -強陽離子交換基團2、羧甲基(CM) - 弱陽離子交換基團
            因為強離子交換基團的活性基團在很大的pH范圍內均可保持帶電,它可以在蛋白質結合所需pH值是特別強的酸性或堿性的情況下使用(假設該pH值下蛋白質穩定性仍得以保持)。有些蛋白質在弱離子交換上的保留較弱,使得它們可以用較低的離子強度洗脫 。由于高離子強度會影響部分蛋白質的穩定性,而弱離子交換不需要在ji端的pH值條件下進行蛋白質的結合,因此可能對蛋白質更合適。
            離子交換色譜的固定相首先用低離子強度的緩沖液平衡,然后將蛋白質樣品用和平衡過程相同離子強度的緩沖液上樣到固定相。結合的蛋白質在用更高離子強度或pH值不同(圖6)的緩沖液洗脫前先淋洗一段時間。洗脫緩沖液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用,取代了柱上的蛋白質。在離子交換層析中,某些鹽類代替結合蛋白和保持蛋白質穩定性的能力,可能比其他種類的鹽可能更有效 。
            NaCl或KCl是洗脫液中*常用的鹽類,其中Na+或K+是陽離子交換層析中的抗衡離子,Cl-是陰離子交換層析中的抗衡離子。另一方面,還可以通過調節緩沖液的pH值來減少蛋白質的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對于結合到陽離子交換固定相上的蛋白質,增加緩沖液pH值會使蛋白質所帶正電荷減少,因此可將其從柱上洗脫下來。對于結合到陰離子交換固定相上的蛋白質,降低pH值可減少蛋白質所帶負電荷將其從柱上洗脫下來。
            同時,還可以調節緩沖液的pH值使目標蛋白質不與離子交換固定相相結合,而與此同時雜蛋白與固定相結合。如此,可在穿透液中收集目標蛋白質,而雜蛋白通過與固定相結合得以去除。
            與其他層析方法相比,離子交換層析在確定蛋白質結合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的*佳條件時可能需要解決更多的問題。


            凝膠過濾層析

            凝膠過濾又稱為分子篩及體積排阻,體積排阻層析是根據蛋白質具有不同的水力學半徑將它們進行分離,該數據主要通過測量分子尺寸和形狀兩方面信息獲得。與上述其他層析過程不同的是,蛋白質不與SEC的固定相相結合,而是依靠它們通過惰性固定相的速度不同來完成分離。

            圖 9. 三種不同水力學半徑的蛋白質混合物用體積排阻色譜柱分離。


            大蛋白因為不能進入介質孔道內部而只能直接流經柱體*先流出。稍小的蛋白質會進入介質孔道內部,流經的路徑更復雜,因此需要更多的時間來穿過介質并流出柱體
            基于SEC可分辨不同種類蛋白的能力,它通常是一種用于*后一步純化的有效方法。低聚物 、去折疊的蛋白分子和缺失蛋白都可以在逐漸置換緩沖液的過程中與結構完整的天然蛋白質分子分離開。通常,由于SEC可使用溶劑種類更多,所用的緩沖鹽也更少,因此比透析的緩沖液置換過程更快也更可靠。整個SEC過程都只使用一種溶劑,而市購的SEC固定相幾乎與所有常規的緩沖液兼容。
            固定相的類型和柱子的長度對蛋白質的SEC分離的分辨率有很大的影響。市場上有很多種固定相可選,其選擇*好是根據待分離蛋白質分子的分子量和分離條件兩方面來決定。
            與其他層析方法一樣,SEC同樣既有優點也有缺點。是否采用SEC要取決于蛋白質本身及其后續應用的要求。
            SEC的優點:1、可進行緩沖液交換和脫鹽。2、可分離其他純化技術難以分離的相似品種(如蛋白片段和低聚物)。3、可與多種溶劑相容。4、不依賴于蛋白質的任何一種特殊形式進行保留和洗脫。
            SEC的缺點:1、分離效果嚴重依賴柱子的填裝效果。2、蛋白質與介質間有非特異性相互作用,會降低分辨率。3、對復雜的蛋白質混合物分辨率低。4、為保證足夠的分辨率,上樣量必須較小。這對沉淀得到的高濃度蛋白質是一個問題。
            要優化SEC條件以獲得*好的分離效果,常常需要耗費大量時間,而一些因素會對分離效果產生非常大的影響。
            提高SEC分離效果的條件:1、上樣體積盡量*小。上樣體積越小,洗脫組分的擴散將會越弱。2、緩沖液中加鹽。少量的鹽有助于防止蛋白質與固定相間的非特異性相互作用。這將保證所有的蛋白質可以穩定地流過整個層析柱。3、采用合適的流速。流速過快使得小分子沒有足夠的時間流經介質孔道,流速過慢則會導致樣品擴散時間增加。4、保證樣品和溶劑的黏度接近。調整樣品的條件使其與洗脫緩沖液的類似。5、調整層析柱長度。柱子過短使蛋白質分離不充分。而柱子過長則使得蛋白質樣品擴散嚴重。6、重裝柱子。柱子的填裝效果會蛋白質的分離效果有相當大的影響。如果介質顆粒沒有分布均勻或者填裝時帶入氣泡,蛋白質將不能順利地流過固定相。此外,如果柱子跑干了,就必須重裝。柱子填裝不好通常就是分離效果不好的原因。
            由于SEC并不是基于蛋白質官能團間的相互作用來進行分離,所有的蛋白質都在相同的條件下進行洗脫,所以分離效果僅僅依賴于蛋白質各自不同的水力學半徑。因此,SEC通常不適合在含有較多雜蛋白的純化工藝前期使用。但是,SEC又可作為一種快速可靠的樣品脫鹽或者小分子去除方法用于分離工藝前或中期。在純化的*后階段,當只剩痕量雜蛋白時,SEC則是一種蛋白質分離和置換保存緩沖液的有效方法。
            以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結蛋白質純化方法經典攻略(三)。
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